Nespoli entra nel 1977 nella Scuola Militare di Paracadutismo di Pisa, dove ottiene la qualifica di sottufficiale istruttore di paracadutismo. Nel 1980 fa il suo ingresso nelle Forze speciali italiane, ottenendo la qualifica di incursore paracadutista. Viene inviato in Libano nella Forza Multinazionale di Pace, dal 1982 al 1984; col grado di maggiore, è un ufficiale della riserva dell'Esercito Italiano. Ottiene a New York un Bachelor of Science in Aerospace Engineering nel 1988 e un Master of Science in Aeronautics and Astronautics nel 1989 presso il Politecnico della New York University. Nel 1990 consegue la laurea in Ingegneria meccanica presso l'Università degli Studi di Firenze. Lavora per ESA dal 1991 e parte per la sua prima missione nel 2007. In totale, nelle tre missioni del 2007, del 2010-2011 e del 2017 Paolo Nespoli è rimasto nello spazio per 313 giorni, 2 ore e 36 minuti. In seguito al ritiro dalla sua carriera da astronauta, dal 2023 insegna al Politecnico di Milano presso il corso di Space Engineering la materia Human Spaceflight and Operations.